1. Тип оборудования, используемого для сбора материала в трофологических исследованиях, зависит от размерно–возрастной группы объектов исследований.
Отлов личинок рыб проводят пелагическим или донным тралом. В мелководной прибрежной зоне облов производится с помощью ихтиопланктонной малой сети (диаметр обруча 50–56 сантиметров), сачком или мальковой волокушей. Личинок помещают в герметичный контейнер, фиксируют 4–8 % раствором формалина и оснащают этикеткой с указанием места, даты и времени сбора.
Молодь облавливается неводами или бреднями с ячеей, соответствующей размеру особей. Для мальков размером 3,5–4,5 сантиметров – 10–метровый бредень или трал; для сеголеток – 25–50–метровый невод; для более старших возрастов – 75–100–метровый бредень. Мелкоразмерные экземпляры (длиной до 20 сантиметров) помещают в герметичный контейнер с 4–8% формалином целиком, при этом у наиболее крупных особей (15–20 сантиметров) делается надрез на брюшной стороне.
Для отлова взрослых особей используются промысловые орудия лова (невода, тралы, ставные и плавные сети с выборкой материала через 2–3 часа). Применение пассивных орудий лова с выемкой материала раз в сутки и реже значительно снижает качество материала в результате переваривания пищи.
При извлечении внутренностей желудочно–кишечный тракт (далее – ЖКТ) вырезается ножницами от пищевода до анального отверстия и помещается в марлевую салфетку вместе с этикеткой, в которой указывается место, дата сбора, вид рыбы и ее порядковый номер в журнале. При наличии большого количества материала можно ограничиваться порядковым номером рыбы на этикетке в целях экономии времени. В случае исследования хищных рыб с четко выраженным желудком извлекается и фиксируется только желудок. Фиксация выполняется 4–8 % раствором формалина в герметичном контейнере. Контейнеры с зафиксированным материалом после заполнения желательно поместить в кулер–холодильник, в котором и проводится перевозка в лабораторию.
Одновременно со сбором материала на трофологию должен проводится сбор гидробиологических, гидрохимических и гидрологических параметров исследуемого участка водоема.
2. Перед началом анализа содержимого ЖКТ фиксированный материал отмывается от формалина. Для этого зафиксированная рыба или кишечники помещаются в сосуд под проточную воду.
В случае отсутствия проточной воды, фиксированный материал отмывается путем замены воды в сосуде несколько раз.
3. Для зафиксированных целиком особей проводится индивидуальный биологический анализ с измерением размеров и веса (с точностью до 1 миллиметра и 0,001 грамма). Перед взвешиванием анализируемый экземпляр обсушивается на фильтровальной бумаге до исчезновения мокрого пятна. Все промеры заносятся в протокол исследования.
Следующим этапом является извлечение кишечника из брюшной полости, измерение его длины (при необходимости) и оценка степени наполнения пищей отдельных отделов ЖКТ с указанием: 0-пусто; 1 – единичные организмы; 2 – мало; 3 – среднее; 4 – много; 5 – масса.
Затем ЖКТ разрезается на отделы и остатки пищи извлекаются по отдельности на стекло или чашку Петри с помощью скальпеля или шпателя. У мелких особей или мальков пищевой ком из кишечника извлекается изогнутой иглой. При наличии желудка его содержимое анализируется отдельно от содержимого кишечника.
Каждая часть пищевого кома обсушивается на фильтровальной бумаге до исчезновения мокрого пятна и взвешивается с точностью до 0,01 грамма. При наличии в пищевой массе слизи или остатков эпителия необходимо их удалить. Для удаления слизи из пищевого кома рекомендуется растворить ее, поместив всю массу в 3–5 % раствор щелочи (NaOH или KaOH) на 30–40 минут.
При возможности крупные организмы выбирают из пищевого кома, подсчитывают и определяют их вес. Вес оставшихся мелких организмов вычисляют путем исключения веса крупных из веса всего пищевого кома.
При анализе питания личинок рыб важно получить данные о видовом составе пищевых организмов, их количестве и размерах. Ввиду малого веса пищевого кома личинки проводят взвешивание объединенного пищевого кома группы одноразмерных особей.
Пищевой ком планктофага, после выделения крупных организмов, анализируется как при работе с планктоном. Пищевая масса (или часть ее) размешивается в сосуде с определенным количеством воды и с помощью штемпель–пипетки отбирается две порции для проведения качественного и количественного учета организмов с последующим перерасчетом на весь объем. Наличие в пищевом коме планктофага растительных частиц, чешуи, песка отмечают в протоколе как случайные компоненты, не учитывая их вес.
Приемы, применяемые при изучении бентофагов различны для видов, имеющих и не имеющих желудок.
У рыб, имеющих желудок отдельно взвешивается содержимое желудка и кишечника. Пищевая масса кишечника сложно поддается идентификации, вследствие чего в ней, по возможности, определяются преобладающие организмы.
У рыб, не имеющих желудка, при изучении питания применяют комбинированные методики, так как пища находится в раздробленном состоянии. Содержимое пищевого тракта взвешивают, помещают в чашку Петри, заливают водой и разбирают. По наиболее крупным, хорошо сохранившимся частям определяют организмы и их размер, численность и вес. Чаще всего невозможно провести достоверный учет всех фрагментов. В таком случае процентное значение компонентов преобладающей группы оценивают на глаз. Более малочисленные организмы просчитывают или взвешивают. Значимость трудновыделяемых компонентов (водоросли, песок, детрит) при невозможности взвешивания определяют примерно.
У хищных рыб анализируется содержимое желудка путем взвешивания, просчета и определения видовой принадлежности жертв.
4. Для количественной характеристики питания устанавливается частота встречаемости, вес пищевых компонентов и индекс наполнения.
Частоту встречаемости компонентов (F) в пищевом коме рассчитывают в процентном соотношении как отношение числа кишечников с данным компонентом к общему числу кишечников. При этом, нужно указывать, учитывались ли пустые кишечники.
Весовая доля компонента (P) рассчитывается, как отношение веса данного компонента к весу всего пищевого кома, в процентах для группы рыб или отдельной особи.
Индекс относительной значимости компонентов питания IR (Решетников и другие, 1993). Расчет ведется по формуле:
IR=FiPi/∑FiPi
где: Fi – частота встречаемости компонента, Pi – весовая доля компонента.
Для получения индекса наполнения фактический вес пищевого кома или его компонентов относят к весу рыбы и умножают на 10000 (%, для мирных рыб) или на 100 (%, для хищных).
Для выявления объема конкуренции рассчитываются индекс сходства пищи, согласно методического пособия по изучению питания и пищевых отношений рыб, выраженный в процентах путем сравнения состава пищи двух и более видов рыб, с указанием организмов, которые общие для каждого вида. Сумма меньших процентов, независимо от того, в составе пищи какого из двух и более видов данный организм встречается, дает степень сходства пищи. В случае полного совпадения состава пищи степень сходства пищи каких–либо двух видов будет равняться 100, при полном различии– 0.
5. Отбор проб и методы определение возраста рыб проводится следующим образом:
1) сбор чешуи у всех видов рыб с середины тела, под передней частью спинного плавника. В случае, когда спинных плавников несколько, то чешую берут под первым, расположенным ближе к голове. Для проведения исследования возраста рыбы отбирается 10 чешуек. Далее чешую кладут на лист чешуйной книжки, с занесением сведений о рыбе, с которой взята чешуя: номер и название рыбы. Затем чешуйную книжку подвешивают для просушки.
Чешую в течение 1–10 минут размачивают в 5% растворе нашатырного спирта. Размоченную чешую протирают кисточкой. Затем зажимают между двумя предметными стеклами и дают просохнуть.
Для определения возраста по чешуе раскладывают чешую на предметное стекло, накрывают мелкую – покровным стеклом, крупную – вторым предметным стеклом и определяют возраст под бинокулярным микроскопом, при разном увеличении в зависимости от размера чешуи;
2) извлечение кости (отолит) у мелких рыб путем разрезания головы вдоль средней линии, а также используется и другой способ, отрывают и обнажают нижнюю сторону черепа надрезав тонкие кости над слуховой капсулой вынимают отолит пинцетом. У крупных рыб разрезают голову поперек в затылочной части, отолиты вынимают пинцетом, при этом жаберную крышку отгибают, сдвигают скальпелем мышцы со слуховой капсулы, срезают наружную стенку слуховой капсулы и осторожно извлекают отолит.
Позвонки рыбы чаще всего берут наиболее крупные, расположены близ головы. Для получения нужно вырезать тела рыбы и позвонки удается вынуть. Позвонки очищают от остатков тканей.
При обработке кости (отолит, позвонок) помещается в 25% нашатырного спирта, способствующий его обезжириванию. В аммиаке выдерживается 4–5 часов. После такой обработки промывается в горячей воде и затем рассматривается под микроскопом в капле глицерина.
Отолиты. В зависимости от величины отолита его изучают под лупой или бинокуляром, подбирая соответствующие увеличения. Отолиты покрывают со всех сторон бензолом, разламывают отолиты посредине, сломы подшлифовывают на оселках, помещают обе половины в ванночку с воском разломом кверху и рассматривают при падающем свете.
Позвонки. Чтобы определить годовые кольца на позвонках, рассматривают сочленовные ямки позвонка под микроскоп. Для этого позвонки кладут в ванночку с воском, устанавливая позвонок сочленовной ямкой к верху;
3) определение возраста рыб по спилам костного луча грудного плавника. Чтобы вырезать луч, надо сделать надрез лопасти плавника вдоль костного луча. Затем полукруговым движением ножа перерезают соединительно тканные связки, отделяют и вылущивают головку из сочленованной ямки. Каждый луч заворачивают в этикетку, завязывают и развешивают для просушки.
Поперечные срезы костного луча выпиливают лобзиком с двумя пилками. Срез делают у самой головки луча, не далее 1 сантиметра от нее. Готовый срез шлифуют на напильнике. Срезы просматривают в просветляющих жидкостях. Для этого нужно употреблять бензол.
Лучи плавников. Возраст по срезам определяют под микроскопом или бинокуляром. При просмотре срезов пользуются препаровальными иглами, чтобы легко переворачивать и передвигать срезы, а также считать годовые слои.
6. Для сбора материала и определение возраста рыб применяется следующее оборудование:
1) орудия лова (трал, ставные сети, невод);
2) весы;
3) сантиметровые ленты;
4) аммиак (5–25%);
5) бензол;
6) воск;
7) микроскоп;
8) скальпели, пинцеты, лобзик, ножницы, нож, препаровальные иглы;
9) чешуйная книжка;
10) ванночки эмалированные, чашки Петри, предметные стекла;
11) журнал для записей.
7. Для определения пола рыбы и стадий зрелости половых продуктов учитываются следующие стадии развития особи:
1) неполовозрелые особи – juvenales. Половые железы неразвиты, плотно прилегают к внутренней стороне стенок тела (по бокам и ниже плавательного пузыря) и представлены длинными узкими шнурами или лентами, по которым нельзя глазом определить пол (стадия I);
2) созревающие особи или развивающиеся половые продукты после икрометания. Половые железы начали развиваться. На шнурах образуются затемненные утолщения, в которых уже узнаются яичники и семенники. Икринки настолько мелки, что не видны невооруженным глазом. Яичники от семенников (молок) отличаются тем, что вдоль первых по стороне, обращенной к середине тела, проходит довольно толстый и сразу бросающийся в глаза кровеносный сосуд. На семенниках таких крупных сосудов нет. Половые железы малы и далеко не заполняют полости тела (стадия II);
3) особи, у которых половые железы хотя и далеки от зрелости, но сравнительно развиты. Яичники значительно увеличились в размерах заполняют от 1/3 до 1/2 всей брюшной полости и наполнены мелкими непрозрачными, белесоватыми икринками, ясно различимыми невооруженным глазом (стадия III).
Семенники имеют более расширенную переднюю часть и сужаются. Поверхность их розоватая, а у некоторых рыб – красноватая от обилия мелких разветвляющихся кровеносных сосудов. При надавливании из семенников нельзя выделить жидких молок. При поперечном разрезе семенника края его не округляются и остаются острыми. В этой стадии рыба находится долго: многие виды (сазан, лещ, вобла и другие) – с осени до весны следующего года;
4) особи, у которых половые органы достигли почти максимального развития. Яичники очень велики и заполняют до 2/3 всей брюшной полости. Икринки крупны, прозрачны и при надавливании вытекают. При разрезе яичника и скоблении разреза ножницами икринки соскабливаются поодиночке. Семенники белого цвета и наполнены жидкими молоками, которые легко вытекают при надавливании брюшка. При поперечном разрезе семенника края его тотчас округляются, и разрез заливается жидким содержимым. Эта стадия у некоторых рыб непродолжительна и быстро переходит в следующую (стадия IV);
5) особи, у которых икра и молоки настолько зрелы, что свободно вытекают не каплями, а струей при самом легком надавливании. Если держать рыбу в вертикальном положении за голову и потряхивать ее, то икра и молоки свободно вытекают (стадия V текучие особи);
6) особи, у которых половые продукты выметаны совершенно. Полость тела далеко не заполняется внутренними органами. Яичники и семенники очень малы, дряблы, воспалены, темно–красного цвета. Нередко в яичнике остается небольшое количество мелких икринок, которые претерпевают жировое перерождение и рассасываются. Через несколько дней воспаление проходит, и половые железы переходят в стадию II–III (стадия VI отнерестовавшие особи).
При неразвитости половых продуктов, находящихся на промежуточной стадии она обозначается двумя цифрами, с учетом приближенности к стадии развития особи. Например: III–IV; IV–III; VI–II.
8. Упитанность рыб как универсальный показатель, характеризует содержание жира в организме и физиологическое состояние рыбы.
Для численного выражения упитанности используется следующая формула:
где: F – коэффициент упитанности;
l – длина рыбы;
Q – масса рыбы.
9. При сборе материала на плодовитость, выловленные самки подвергаются полному биологическому анализу, с учетом места и даты отлова, длины (l) и веса (Q, q) рыб.
Гонады IV стадии зрелости взвешиваются на весах. Яичники с массой более 1000 грамм взвешиваются с точностью до 1 грамма, массой 300 – 1000 грамм – с точностью до 0,5 грамма, массой менее 300 грамм с точностью до 0,1 грамма.
Из средней части гонады берут навеску от 2–10 грамм с точностью до 0,001 грамма и записывается информация, где указываются: водоем, дата наблюдения, виды рыб, номер особи. Затем отобранную пробу вместе с отраженной информацией завязывают в марлевую салфетку и опускают в фиксирующий 4%–й раствор формалина.
В лабораторных условиях в каждой навеске просчитывается число икринок с последующим перечетом на вес всей гонады.
После фиксации, путем взвешивания вновь определяется масса пробы. Из нее берется 1 грамм икры, избытки влаги забираются фильтровальной бумагой и икра взвешивается с точностью до 0,1 миллиграмма. Затем икринки помещают в чашку Петри с добавлением воды и производят разделение икринок с помощью препаровальных игл и скальпеля, после чего они поштучно просчитываются кончиком скальпеля или препаровальной иглой. Данная операция проводится на темном фоне. При подсчете количества икры, икринки группируются в кучки по 10 штук в каждой, с объединением по 10 штук, получая группы по 100 икринок. Количество групп подсчитывается и складывается с оставшимся количеством икринок, не вошедшим в группу и расчитывается по следующей формуле:
где: NАИП – абсолюная индивидуальная плодовитость;
Qгонад – вес гонады;
nикр – количество икры в 1 граммах.
10. При сборе материала и определения плодовитости применяется следующее оборудование:
1) орудия лова (трал, ставные сети, невод);
2) весы;
3) сантиметровые ленты,
4) емкости для фиксации и хранения материала;
5) микроскоп;
6) скальпели, пинцеты, ножницы, препаровальные иглы;
7) фиксаторы (формалин);
8) ванночки эмалированные, чашки Петри, предметные стекла;
9) журнал для записей.
11. Для определения жизненного цикла рыб учитываются следующие этапы развития особи:
1) эмбриональный период развития рыб;
Эмбриональный период – oт момента оплодотворения яйца до перехода молоди на внешнее питание. Эмбриональное развитие (онтогенез) у рыб зависит от количества содержимого желтка в яйце. В соответствии с этим, у разных классов рыб основные этапы эмбрионального развития бластула, гаструла и нейрула сохраняются вне зависимости от таксономической принадлежности, но заметно отличаются на некоторых стадиях среди отрядов, семейств, родов и видов. Время и специфичность стадий эмбриогенеза устанавливается в зависимости от вида рыбы и условий содержания в водной среде (абиотических факторов);
Эмбриональный период развития семейства карповых (Cyprinidae) на примере карпа (Cyprinus carpio) представлен следующим образом:
1) I этап – оплодотворение и подготовка к дроблению яйца. В первые мгновения после оплодотворения оболочки икринки прилегают к поверхности желтка. Затем кортикальные альвеолы, располагающиеся в поверхностном слое цитоплазмы, лопаются, их содержимое выделяется под оболочку и отслаивается от желтка. Начинается оводнение (набухание) икринки, в процессе которого между желтком и оболочкой образуется перивителлиновое пространство, заполненное жидкостью;
2) II этап – дробление и бластуляция. После оплодотворения происходит отслоение оболочки от желтка, набухание икры, образование зародышевого диска, дробление бластодиски, образование бластулы. Через 6 часов наступает стадия морулы крупных клеток. Между бластодиском и желтком возникает небольшая полость, или бластоцель;
3) III этап – гаструляция и формирование зародыша. Происходит полное обрастание желтком (бластодермой) через 8–9 часов. Процесс гаструляции сопровождается повышенной гибелью икры. Процесс гаструляции заканчивается образованием кишечной трубки и первичного рта (бластопор);
4) IV этап – нейруляция. Дифференциация головного и туловищного отделов зародыша. 17-20 часов после оплодотворения икры тело зародыша охватывает около 3/5 окружности желтка. Начинается сегментация тела. В туловище образуются первые два–три сомита. В возрасте 22–24 часов формируются глазные пузырьки;
5) стадия IV.I - обособление хвостового отдела. Зародыш начинает двигаться. Кишечная трубка приобретает грушевидную форму. Через 35–45 часов в глазах отчетливо виден хрусталик;
6) стадия IV.II - на шестом этапе в возрасте 2,5 суток у эмбриона появляются форменные элементы в крови. Число сомитов в туловище – 24, в хвостовом отделе – 16. Глаза пигментированы. Голова пригнута к желтку. Снизу образуется ротовая воронка.
7) стадия IV.III - выклев эмбриона. Выклюнувшиеся эмбрионы (предличинки) имеют относительно слабо пигментированные глаза и тело. Пигментные клетки расположены на голове и вдоль хорды. Голова выпрямлена и отделена от хвоста, грудные плавники маленькие. Рот неподвижный, в форме ямки, в нижнем положении.
Эмбриональный период развития семейства осетровых (Acipenseridae) на примере русского осетра (Acipenser gueldenstaedtii) представлен следующим образом:
1) I этап – оплодотворение и подготовка к дроблению яйца. Диаметр яйца составляет 2–4 миллиметра, они имеют сферическую или слегка эллипсоидную форму и окрашены в коричневато–серый цвет. На анимальном полюсе в оболочке на площадке диаметром 100 микрометров расположены микропиле. Обычное число их 5–10, но иногда достигает и 40. Происходит оплодотворение;
2) II этап – дробление и бластуляция. Дробление яиц происходит в результате ряда последовательных митотических делений клетки, вследствие чего образуется многоклеточный зародыш;
3) III этап – гаструляция и формирование зародыша. Гаструляция начинается с появления в краевой зоне, в том месте, где располагался светлый серп, примерно на уровне экватора, интенсивно пигментированной темной полоски. В этом месте клетки начинают погружаться внутрь и образуется узкая щель, которую называют первичным ртом или бластопором. Отверстие бластопора ведет в узкую полость гаструлы или первичной кишки – архентерон. В верхней части зародыша располагается большая первичная полость – бластоцель;
4) IV этап – нейруляция. По окончании гаструляции у зародыша постепенно формируются зачатки всех основных органов. После замыкания бластопора на спинной стороне появляется утолщенная пластинка, называемая нервной пластинкой, так как из нее развивается центральная нервная система;
5) стадия IV.I. - изменение формы тела. Расширенная часть кишки из шаровидной становится эллипсовидной, значительно удлиняются и распрямляются задний отдел туловища и хвост. Снизу, в основании головы появляется ротовая ямка в виде небольшого впячивания эктодермы. В жаберном отделе также в виде впячиваний эктодермы возникают наружные жаберные карманы. Происходит выклев.
Эмбриональный период развития семейства лососевых (Salmonidae) на примере радужной форели (Oncorhynchus mykiss) представлен следующим образом:
I этап – оплодотворение и подготовка к дроблению яйца. Икра имеет анимальный и вегетативный полюсы. Внешняя оболочка икринки ручьевой форели имеет толщину в 33–37 микрометров, тогда как у радужной форели она тоньше. На оболочке можно наблюдать поры в 1 микрометр, которые продолжаются узкими каналами. На анимальном полюсе икринки располагается микропиле, через которое сперматозоид проникает внутрь;
II этап – дробление и бластуляция. Оболочка отделяется от самой клетки перивителлиновым пространством, которое через 20–60 минут после оплодотворения наполняется жидкостью. Эта перивителлиновая жидкость позволяет эмбриону свободно вращаться внутри оболочки, всегда оставаясь в нужной позиции. Во время набухания объем икринки увеличивается на 12–20 процентов;
III этап – гаструляция и формирование зародыша. Начало гаструляции (3,5 суток). Во время гаструляции материал нервной системы, органов чувств, хорды, энтодермы и мезодермы обособляются путем координированных движений отдельных бластомеров. На заднем конце кишечного тяжа появляется небольшая полость – купферов канал. У радужной форели он увеличивается до 200 микрометров;
IV этап – нейруляция. Рост в длину происходит на поверхности желточного мешка. Образовавшиеся и увеличивающиеся глазные бокалы и утолщающиеся стенки среднего и боковых мозговых пузырей способствуют отчленению головы от желточного мешка.
Стадия IV.I. - перед началом отчленения заднего конца тела у зародыша образуется пульсирующее сердце. Происходит закладка грудных плавников и жаберного аппарата, образуется рот.
Стадия IV.II. - голова, вначале крючковидно загнутая к низу. Постепенно по мере ее отчленения от желточного мешка выпрямляется. Ее полное выпрямление сопровождается удлинением всего тела и расширением плавниковых складок, а также уменьшением объема желточного мешка.
Стадия IV.III. - перед выклевом эмбрион начинает все больше и больше вращаться внутри икринки. Эти движения механически утоньшают оболочку икринки изнутри. Кроме того, предличинки расщепляют оболочку специальным ферментом (гиалуронидазой), который секретируется железой, находящейся на голове эмбриона;
2) этап развития личинок и молоди рыб:
A – большой желточный мешок. Плавниковая складка почти не дифференцирована. Плавательный пузырь без воздуха;
B – желточный мешок еще сохраняется. Плавниковая складка начинает дифференцироваться на спинную, хвостовую и брюшную части. Плавательный пузырь наполнен воздухом;
C1 – желточного мешка нет. Появляются небольшие сгущения механизмы в спинном и подхвостовом отделах каймы, а также в нижней хвостовой лопасти;
C2 – в нижней хвостовой лопасти развиваются первые мезенхимные лучи, направленные косо вниз. Конец хорды слегка загибается вверх. В спинном и анальном плавниках хорошо заметны сгущения мезенхимы;
D1 – задний конец хорды направлен вверх. В хвостовом плавнике костные лучи. Хвостовой плавник слабовыемчатый, над ним образуется перепончатая лопасть. В спинном и анальном плавниках появляются мезенхимные лучи;
D2 – хвостовой плавник выемчатый. В спинном и анальном плавниках развиваются костные лучи. Есть зачатки брюшных плавников, не выходящие за края плавниковой складки. Плавательный пузырь двухкамерный;
E – лучи развиты во всех плавниках. Брюшные плавники выходят за края плавниковой складки;
F – на хвосте и вдоль боковой линии появляется чешуя. Обонятельные ямки еще не разделены перегородкой. Преанальная плавниковая складка к концу этапа полностью исчезает;
G – все тело покрыто чешуей. Обонятельная ямка разделена перегородкой.
12. Принцип метода определения возраста тюленя по слоям цемента в клыках основан на факте непрерывного образования цемента в слоях между корнями зубов тюленя. Клыки большинства настоящих тюленей рано прекращают рост в длину, и для подсчета слоев в дентине можно делать поперечные шлифы в средней части зуба.
При отборе проб клыки хорошо отмываются от крови и остатков тканей и насухо вытираются или высушиваются. Зубы следует поместить в небольшие желатиновые капсулы, чтобы они не повредились или не потерялись.
Для получения окрашенных препаратов зуб или кость декальциницируют, промывают, режут на микротоме и срезы окрашивают гистологическими красителями. Декальцинировать в 4–5%–м растворе азотной кислоты. Время декальцинации зависит от размера объекта, плотности зуба и от способа его хранения (5–6 часов). В растворе азотной кислоты декальцинация хранившегося в сухом виде материала длится от полусуток до нескольких суток. Мягкий декальцинированный зуб промывается в проточной воде в течение 10–24 часов. Далее при обработке применяется парафин. Промытый зуб или кусок зуба резают на замораживающем микротоме на срезы 20 микрометров. Полученные срезы помещаются в дистиллированную воду, окрашиваются гематоксилином, промываются проточной водой и фиксируется глицерином.
После окраски срезы дифференцируют, помещают на несколько секунд в бюксы 70%–ным спиртом, с добавлением 2–3 капель соляной кислоты, и переносятся в воду. После дифференцировки срезы промываются 10–15 минут в проточной воде. Срезы помещают сначала в 25%–ный, затем в 50 и 75%–ный раствор глицерина в воде. В каждом растворе срезы находятся не менее 5–10 минут. Крупные срезы переносят по всем растворам препаровальной иглой, слегка согнутой в середине. С одного зуба берется несколько срезов. Такие препараты сохраняются в течение 2–3 лет. Ростовые слои выявляют на окрашенных тонких срезах и считают под микроскопом.
Оборудование, необходимое для сбора материала и определение возраста по клыкам:
1) 4–5% азотной кислоты;
2) парафин;
3) замораживающий микротом;
4) гематоксилин;
5) глицерин;
6) 70% спирт;
7) соляная кислота;
8) микроскоп;
9) предметные стекла;
10) журнал для записей.